关于m6A-IP-qPCR和RIP-qPCR公开课问题集锦

2月28、29日，我们进行了m6A-IP-qPCR和m6A-RIP-qPCR的线上培训课程，错过的老师扫描下图中的二维码即可回看

m6A-IP-qPCR课程（上），主要讲解关于m6A-IP-qPCR一些实验m6A-RIP-qPCR课程（下），主要讲解m6A甲基化酶的一些RIP-qPCR小知识

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这两次课程介绍的是“m6A-IP-qPCR该怎么做”，由于同时在线提问，有部分老师的问题未来得及第一时间解答，于是我们将问题进行了收集整理，给出了解答。

一、m6A-IP-qPCR相关问题

问题1：老师您好，目前我们通过转录组测序发现一个基因，发现这个基因的m6A也存在显著差异，同时也发现这两个材料里的去甲基化酶有显著差异，推测基因A的差异是由于甲基化引起的，而甲基化的差异是由于去甲基化酶的差异引起的，但以上的都是推测，请问下一步该如何更好证明？

答：第一步，用siRNA或者CRISPR-Cas9的方法敲低此去甲基化酶，再用m6A-IP-qPCR检测基因A的甲基化水平后，再检测此基因的自身功能有无受到影响第二步，可以构建A基因的m6A甲基化突变质粒，转染或者导入细胞中，检测此基因的自身功能有无受到影响。一般可以把A碱基替换成其他碱基如C等。具体做法可以回顾之前我们课堂里讲到的内容，详情请点击千人同时在线，联川m6A公开课超长版问答合集1| m6A专题。

问题2：测序之后已经确定了靶基因上发生m6A修饰的区域，是不是针对这些区域来设计引物就可以？

答：如果在m6A-IP-qPCR中时做了打断，那么设计引物时需要针对m6A发生修饰的区域设计；如果在此过程中未做打断，那么由于IP下来的原则上是整条mRNA，引物设计不一定非要针对m6A修饰的区域。请注意，打断的长度不要过短防止引物不好设计。

问题3：内参的选择与普通qPCR有什么区别？

答：m6A-IP-qPCR实验中所谓的“内参”就是Input组，和一般的IP实验是一样的，但和普通qPCR是不一样的（普通qPCR的内参通常是GAPDH等基因）。

问题4：m6A不需要做技术重复吗？

答：这个问题有些简单，我来补全一下。如果是做测序方面，需要做3个以上的生物学重复，不需做技术重复。而如果是做m6A-IP-qPCR，单个样本需要做3个技术重复，同时外加3个生物学重复，也就是总计9×2=18个反应（因为还有9个Input）。

问题5：是否可以使用绝对定量的方法来做呢？

答：没有严格意义上的绝对定量法。主流的相对定量也是能够发主流的高分杂志的，如Nature和Cell的m6A-IP-qPCR很多都是相对定量法。所以目前检测单个基因m6A修饰程度是否有差异，主流的方法就是是m6A-seq和MeRIP-qPCR（也就是m6A-IP-qPCR）。所以说市面上的MeRIP-qPCR试剂盒都是用相对定量的方法。如果不愿意自己配置试剂盒中各种buffer的话，可以购买默克公司出品的millipore m6A试剂盒——Millipore Magna MeRIP™ m6A Kit Transcriptome-wide Profiling of N6-Methyladenosine。其中IP完毕的后续建库部分直接替换成qPCR即可。

问题6：这种方法和RIP试剂盒是类似的吗？

答：MeRIP-qPCR（也就是m6A-IP-qPCR）和RIP不同，两者实验目的不同：前者是检测单基因的m6A水平，后者是检测与阅读蛋白结合的mRNA。在实验方法上也有差异。换句话说m6A抗体直接binding的是RNA，而RIP的一些抗体如YTHDF1 antibody、FTO antibody等抓取的是蛋白，然后再去研究这些蛋白上的RNA。是两种不同的概念。m6A抗体理论上可以结合任何带m6A修饰的RNA，特异性高达99%，不存在非特异性富集情况。

问题7：富集mRNA有试剂盒吗？哪个公司的？求货号。

答：一种是我们联川生物自己内部常用试剂盒，为Thermo Fisher公司出品，货号61006。另一种是安捷伦公司出品的Absolutely mRNA Purification Kit。

问题8：2-△ct这个方法运用的前提，应该是扩增效率接近100%或者与内参相似的前提才行的吧？不然应该是不能这么做的。

答：是的，所以这个实验对RNA的起始量和质量要求很高，在IP后要有足够的RNA进行反转录；同时要对引物进行验证，需要多设计几对引物进行比较。另外，和普通PCR一样，对引物退火温度也需摸索以达到最佳反应条件。

问题9：IP得到的mRNA浓度一般多少是比较适合下一步的qPCR？

答：通常这类问题背后有非常多的细节需要考量，我们来一个个解释。通常我们做常规的qPCR一个反应大概会加入1μL进入整个约25μL的SyberGreen反应体系中。按照约为50-100ng的total RNA来算的话，一般浓度在50-100ng/μL左右。但是这边是mRNA，说明前期rRNA干扰已经不存在，那么一次反应按照RNA与引物有效碰撞效率计算，大约3-5ng就可以够一次PCR反应。当然我们建议非特殊情况还是使用非打断的方式对total RNA直接进行IP，设计常规引物PCR。这类的话浓度控制在50-100ng左右即可。这边不用刻意控制RNA起始量问题。另外请注意反转录效率问题。 

问题10：讲下pri-，pre和mature-microRNA的m6A-IP检测的注意事项吧。

答：pri-miRNA全称为primary microRNA，也叫miRNA初级体。位于细胞核内，是miRNA成熟体加工前，通过DNA上miRNA基因转录出来的初级产物。如上图所示，有polyA结构，有折叠等，更接近于mRNA成熟体的样子。这类pri-miRNA在细胞中存在时间很短，半衰期短意味着很难被捕捉和富集到。这类RNA包括你后面提到的pre-miRNA还有mature miRNA一般我看到论文里很少有人去研究修饰，更多是直接进行普通的qPCR验证。而且验证方式也以mature miRNA居多，pri-miRNA做的人不是很多，更别提要做m6A-IP-qPCR。你可能是想讲miRNA与m6A修饰联系起来对吗？这边建议阅读下我们客户发表的几篇m6A与miRNA的相关研究，可以获得一定的启发。这边需要提示的是，pri-miRNA半衰期过短可以使用质粒载体过表达的方式大大增加其表达量，这样就能被PCR的方式检测到。

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二、RIP-qPCR相关问题

问题1：直接拿YTHDF2抗体拉细胞中的YTHDF2相连的mRNA不可以吗？为什么要转YTHDF2进去？

答：用抗体直接拉细胞中的mRNA更好，更能说明问题，只是我们在具体实验中发现：①不同细胞的YTHDF表达量不同，有些很少，导致IP后几乎得不到产物，很难进行下一步实验；②内源IP时会出现一些假阳性情况。因此，我们选择外源转入质粒的方法。这边需要注意的是，内源性IP的弊端除了刚才提到的假阳性和IP效率低之外，还需要老师培养足够多的细胞。如果YTHDF2本底表达过少，那么15cm的细胞哪怕是10瓶子都不够你IP的。FLAG外源性标签蛋白在这块会效率更高，注意FLAG在载体上设计时不要随着信号肽被加工的时候一起切了导致WB无条带。

问题2：转染一个10cm dish就可以吗？而且怎么确定是YTHDF1还是YTHDF1起作用啊，前期怎么确定？

答：一个10cm dish的细胞量可满足RIP的要求。如何确定YTHDF1还是YTHDF2起作用，在前期，可以通过基因沉默的方法将两个蛋白对应的mRNA进行沉默干扰，检测目的基因的mRNA稳定性和蛋白表达情况：若是蛋白表达降低而mRNA未变化，则是YTHDF1在起作用；若是mRNA稳定性增加，则是YTHDF2在起作用。mRNA稳定性实验请参考Message RNA Half-Life Measurement in Mammalian Cells一文。

问题3：RIP这个实验，可以跑WB吗？不是直接跑qPCR了？

答：在PPT中之所以放WB的图，是因为必须确定质粒已被转染进目的细胞中（若是选择内源IP则不用此步），这是我自己在前期试验中的惨痛教训（前几次IP失败找不出原因，后面才发现是质粒未转染成功）。

问题4：是不是说m6A-IP-qPCR是用m6A抗体去抓带m6A修饰的RNA，从而反应的是某个基因的m6A水平；而今天所讲的，是某个m6A酶的抗体去拉，反应的是这个酶和某个基因的结合？

答：是的，两者在研究目的上有不同，试验方法和原理上类似。需要注意的是，m6A抗体结合的是带m6A修饰的RNA，也就是抗体直接RNA结合。而RIP更多是某种蛋白如YTHDF1（带FLAG或不带FLAG）的抗体与之结合后，研究那些被YTHDF1结合的RNA。前者抓RNA，后者抓蛋白后再去研究RNA。

问题5：m6A相关甲基化酶的RIP，只能是reader和RNA互作吗，可不可是writer或者eraser？

答：在我看来，应该是有writer或者eraser和RNA互作的，只不过现在的文献报道没有reader IP的多。但已经有实验室在做这方面的工作。目前高分文章中，不仅仅是reader会做一些RIP实验，而一些erasers和writers本身也会做一些RIP。如这篇陈建军的Cancer Cell（m6A去甲基化酶FTO对急性骨髓白血病有致癌作用）中，就针对FTO这个蛋白做了RIP-seq。

问题6：IP以后分别做了WB和QPCR，洗脱的时候如何分别收集了蛋白和RNA的？

答：我们在IP前将样品分成了两份，一份做WB，另一份做qPCR。

问题7：内源性的RIP如何提高效率，最后的产物如果是做qPCR可能不需要很多，但是如果测序的话，一般要多少的细胞量比较合适？

答：这个与我在问题1所给出的答案很相似，就不重复了。简单来说内源性IP存在诸多不可控情况。一般做RIP-seq，外源性FLAG大约在5×10的7次方左右（大约10cm~15cm的dish三到四盘）。内源性至少1×10的8次方起，而且需要提前跑WB验证。这边还是不太建议内源性IP。 

问题8：这个RIP的实验，一定要用目标细胞做吗，可以用HEK293T代替吗？

答：一定要用目标细胞做，因为不同的细胞，m6A阅读蛋白的识别可能会不同。

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